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第一篇 总论 1

第一章 病毒的基本特性与传染免疫 1

一、病毒的大小和形态 1

二、病毒的结构与化学组成 3

三、病毒的繁殖过程 3

四、病毒的基因、遗传与变异 6

五、病毒的传染与免疫 6

六、病毒对理化因子的稳定性 10

七、病毒的分类和命名 12

一、概述 17

第二章 病毒学实验常用技术 17

二、实验室注意事项 18

三、常用洗涤、消毒和处理方法 18

四、标本收集、运送和保存 20

五、光学显微镜技术 23

六、病毒分离 25

七、病毒鉴定 26

八、病毒的滴定及其应用 30

九、血清学实验 35

(一) 补体结合试验 36

(二) 中和试验 36

(三) 红细胞凝集抑制试验 38

(四) 凝胶扩散试验 39

(五) 免疫荧光技术 39

(六) 酶标记免疫技术 39

(七) 放射免疫测定法 40

(八) 免疫电镜技术 40

十、病毒快速诊断 41

第三章 电子显微镜技术 43

一、电子显微镜 43

二、电子显微镜技术在病毒学中的应用 47

(一) 标本支持膜与金属载网 47

(二) 超薄切片技术 49

(三) 负染色技术 53

(四) 投影技术(真空喷镀) 55

(五) 复型法 57

(六) 背散射扫描 58

(七) 免疫电镜技术 59

甲、免疫铁蛋白技术 59

乙、简易快速免疫电镜技术 64

(八) 酶标记免疫电镜 65

(九) 放射自显影技术 67

(十) 冰冻蚀刻技术 67

(十一) 核酸分子的观察 68

第四章 组织培养技术 70

一、病毒学实验中使用细胞培养的种类 71

二、在细胞培养中测定病毒的繁殖 72

三、体外细胞培养物的制备 75

(一) 培养液 75

(二) 新鲜组织的处理与贮存 79

(三) 细胞分散技术 79

(四) 细胞计数 87

(五) 各种细胞培养物的制备 88

1. 人源细胞 88

2. 猴源细胞 103

3. 啮齿类源细胞 105

4. 鸡胚细胞 108

5. 蚊虫细胞 109

四、用细胞培养物分离病毒 110

(一) 标本的处理与接种 110

(二) 病毒培养物的孵育 112

(三) 在组织培养中病毒作用的识别 112

五、在单层细胞上滴定病毒的TCD50终点 113

六、病毒蚀斑技术 114

七、组织培养系统的中和试验 123

八、组织培养制备血清学抗原 134

九、细胞培养物的保存、贮藏及运输 140

十、细胞培养物中的支原体污染 143

(一) 细胞培养物中支原体的检查 143

1. 培养基 143

2. 分离培养 144

3. 检查支原体集落 145

4. 支原体的移种 145

(二) 防止支原体污染细胞培养物 146

(三) 从细胞培养物中清除支原体 146

(一) 滤器的型号和用法 147

十一、滤器及其使用 147

(二) 滤器的清洁法 149

十二、组织培养设备 151

(一) 玻璃器皿 151

(二) 塑料培养瓶 152

(三) 橡皮类 152

(四) 杂项 152

十三、培养液和试剂 153

(一) 抗菌素和抗霉素溶液 153

(二) 平衡盐溶液及缓冲盐溶液 154

1. Earle平衡盐溶液 154

3. 磷酸盐缓冲液 155

2. Hanks平衡盐溶液 155

4. pH7.5磷酸盐缓冲液 156

5. 无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液 156

6. Pucks盐水 156

(三) 缓冲溶液-碳酸氢钠 157

(四) 细胞分散剂 157

(五) 50%鸡胚浸液 157

(六) 指示剂及染色液 158

(七) 营养培养液 158

1. Eagles最低必要成分培养液(MEM) 158

2. 水解乳白蛋白--酵母浸液培养液 161

3. Leibovitz--15号培养液(L--15) 162

4. 199培养液 164

5. RPMI1640培养液 170

(八) 营养液 173

1. 20%葡萄糖 173

2. 5%水解乳白蛋白生理盐水 173

(九) 血清 173

(十) 培养液的除菌过滤 173

第一节 病毒的提纯 175

一、病毒提纯一般原则 175

第五章 分子生物学实验技术 175

二、物理提纯法 176

三、化学提纯法 180

四、血清学提纯法 182

五、电泳提纯法 182

六、液体两相分配系统法 182

第二节 病毒的大小及其分子量的测定 183

一、超速离心沉淀法 184

二、微孔薄膜过滤法 186

一、收集细胞 188

第三节 细胞成分的分离提纯 188

二、细胞粉碎方法 189

三、细胞成分分离 189

四、离心分离法 189

五、细胞成分提取法 190

六、线粒体、溶酶体、微粒体的精制 191

七、细胞膜的制备 193

1. 概述 193

2. 纯度的测定 194

3. 细胞膜细片段的制备 196

4. 细胞膜大片段的制备 199

八、无菌染色体的分离 201

九、细胞核和染色质的制备 202

十、病毒感染所致染色体畸变与体外培养制备染色体标本 204

第四节 病毒核酸亚单位的分离与测定 207

一、病毒DNA的分离和测定 207

二、病毒RNA的分离和测定 210

第五节 病毒蛋白质亚单位的分离和测定 214

一、病毒蛋白质亚单位的分离 214

二、病毒蛋白质的测定 215

第六节 核酸分子杂交 216

一、概述 216

二、意义 217

三、核酸的分离提取 218

四、核酸分子杂交方法 222

第七节 RNA-DNA分子杂交法对病毒实验的应用 224

一、基本原理 225

二、材料 226

三、原位杂交法 228

四、结果 228

第八节 病毒的遗传基因与变异 228

一、病毒的基因数 228

二、病毒的基因重组 229

四、病毒的互补 231

三、病毒的基因复活 231

五、病毒的突变 233

(一) 变异剂与诱导变异 233

(二) 温度敏感性变异株的分离和鉴定 236

第六章 病毒免疫化学技术 241

第一节 免疫球蛋白的分离和提纯 241

一、概述 241

二、IgG的提取 242

三、分泌IgA的提取 243

五、IgE的提取 246

四、IgM的提取 246

六、连续提取免疫球蛋白法 248

第二节 凝胶过滤与离子交换层析法 249

一、凝胶过滤 249

二、离子交换层析法 253

第三节 亲和层析纯化法 255

第四节 盘状电泳 258

第五节 醋酸纤维膜电泳 265

第六节 免疫球蛋白的鉴定 268

第七章 细胞免疫实验 271

第一节 白细胞的吞噬功能测定 271

第二节 淋巴细胞有关的实验方法 273

第三节 淋巴素实验法 278

一、概述 284

二、干扰素产生与作用机制 284

第八章 干扰素实验 284

三、干扰素制备 285

四、干扰素测定 286

五、干扰素的提纯浓缩 288

六、干扰素的应用展望 289

第一节 单克隆抗体技术在病毒学上的应用 291

一、概述 291

第九章 单克隆抗体技术与金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)在病毒学上的应用 291

二、细胞融合的主要程序 292

三、骨髓瘤细胞与B细胞融合法 297

四、单克隆化 299

五、特异性抗体与亚类抗体试验 300

六、从小鼠腹水中提取单克隆抗体 301

七、杂交瘤细胞冷藏 303

八、试剂配制 304

第二节 金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)在病毒学上的应用 305

一、概述 305

二、SPA的制备 308

三、SPA在酶标记免疫吸附试验中的应用 309

四、应用SPA提取IgG 310

五、SPA琼脂糖珠6MB亲和层析法分离B细胞 311

六、SPA在放射免疫中的应用 312

七、125碘-SPA放射自显影法 313

八、SPA在病毒抗原检测上的应用 314

九、SPA在病毒抗体检测上的应用 315

十、SPA在免疫电镜上的应用 317

第十章 放射免疫测定法 319

一、概述 319

二、基本原理 320

三、测定方法 322

(一) 放射性同位素的标记 322

1. 放射性同位素的选择 323

2. 氯胺T碘化法 323

3. 气态碘微量扩散标记法 326

(二) 抗血清的制备 326

(三) 保温 326

(四) 分离法 326

1. 电泳与层析 327

4. 沉淀分离法 328

5. 免疫学分离法 328

3. 吸附法 328

2. 凝胶过滤或凝胶平衡 328

6. 固相分离法 329

(五) 标准曲线的制作 329

(六) 固相免疫吸附剂的制备 331

(七) 放射自显影法 333

四、对放射免疫测定法的评价 333

(一) 敏感性 334

(三) 特异性 337

(二) 精确度 337

五、放射免疫测定技术在病毒学上的应用 338

第十一章 气相色谱技术 342

一、概述 342

二、气相色谱仪 342

(一) 基本部件 343

1. 载气 343

2. 注射器 343

3. 色谱柱与加热炉 343

4. 检测器 344

2. 积分仪 346

3. 质谱仪 346

1. 记录仪 346

(二) 辅助部件 346

4. 数据处理装置 347

三、微生物气相色谱分析法 348

(一) 微生物化学成分的分析 349

1. 热解法 349

2. 水解和提取 350

3. 多组分分析 352

(二) 微生物代谢产物的分析 352

(三) 临床标本的气相色谱鉴定 352

四、病毒的气相色谱鉴定 352

(一) 病毒成分的分析 353

(二) 对体外组织培养物的分析 354

(三) 对体内的血清和其他体液的分析 355

五、气相色谱数据的分析 358

第十二章 电子计算机技术 360

一、概述 360

二、电子计算机 360

(一) 计算机的基本构造 361

1. 运算器 361

2. 存储器 362

3. 输入装备 362

4. 输出装备 362

5. 控制器 362

(二) 计算机中的运算方法 363

(三) 计算机的程序编制 365

三、微生物的电子计算机鉴定 366

(一) 微生物的分类鉴定 366

(二) 微生物的图象分析 366

四、病毒感染细胞电子计算机鉴定 367

(一) 细胞分光光度测量法 368

(二) 电子计算机鉴定结果 370

五、文献检索 379

六、怎样评价计算机系统的质量 381

一、荧光显微镜 383

第十三章 免疫荧光技术 383

二、免疫荧光染色原理 385

三、免疫荧光技术程序 386

四、免疫荧光试剂准备 386

(一) 材料 386

(二) 方法 387

1. 荧光素 387

2. 免疫球蛋白的提取 387

3. 荧光素标记抗体方法 387

4. 去除非特异性荧光染色的方法 389

五、荧光抗体染色法 392

六、荧光显微镜检查 410

七、荧光分带技术 410

第十四章 酶标记免疫技术 414

一、概述 414

二、原理与分类 414

(一) 不均一酶标记免疫试验 416

(二) 均一酶标记免疫试验 419

三、器材与试剂 420

(一) 固相载体 420

(四) 抗原结合段片(Fab)的制备 422

(三) 抗体 422

(二) 抗原 422

(五) 血清(样品) 423

(六) 洗涤液 423

(七) 酶 423

(八) 酶结合物制备 425

(九) 底物 431

(十) 间接法测定抗体所需的器材与试剂 433

四、酶标记免疫试验方法 435

(一) 均一酶标记免疫试验 435

(二) 不均一酶标记免疫试验 436

1. 酶结合物最适浓度测定 438

(三) 预备试验 438

2. 抗原最适浓度测定 439

3. 底物最适时间测定 439

(四) 正式试验 439

1. 间接法检测抗体 439

2. 双抗体夹心法检测抗原 441

3. 酶标记抗原竞争法检测抗原 441

4. 竞争性酶标记免疫试验检测抗原 442

5. 特定抗原基质球(DASS)法 443

6. 酶标记免疫组织抗原定位法 448

7. 无标记抗体酶(NLAbE)法 449

8. 可溶性酶-抗酶复合物(PAP)法 450

9. 四步抗体法 451

10. 组织固定法 452

11. 免疫球蛋白桥免疫显色法 455

12. 可溶性酶-抗酶显色法 456

五、在病毒学中的应用 456

第十五章 鸡胚培养法 458

一、概述 458

二、具材 458

四、接种与收获 459

(一) 绒毛尿囊膜接种法 459

三、鸡卵的选择与孵育 459

(二) 尿囊腔接种法 462

(三) 卵黄囊接种法 463

(四) 羊膜腔接种法 463

第十六章 动物实验法 464

一、概述 464

二、动物实验室的设施与工作制度 464

三、实验动物的选择 465

四、啮齿类实验动物的病毒感染 467

五、动物接种法 470

(一) 接种标本的准备 470

(五) 腹腔接种 471

(六) 脑内接种 471

(二) 接种动物的准备 471

(四) 皮下接种 471

(三) 皮内接种 471

(七) 静脉接种 472

(八) 鼻腔接种 472

六、动物采血法 473

(一) 心脏采血 473

(二) 羊和小牛颈外静脉采血 473

(三) 羊和小牛颈动脉放血 473

七、动物解剖法 473

腺病毒科 475

第二篇 各论 475

第十七章 腺病毒 477

一、概述 477

二、病毒的特性 477

三、实验程序 487

四、病毒分离 487

五、病毒鉴定 488

六、酶标记免疫试验 492

八、免疫电镜技术 493

九、血清学实验 493

七、免疫荧光快速诊断 493

疱疹病毒科 495

第十八章 单纯疱疹病毒 499

一、概述 499

二、病毒的特性 499

三、实验程序 502

四、病毒分离 503

五、病毒鉴定 504

六、单纯疱疹病毒-肿瘤-相关抗原(Ag-4)试验 506

七、酶标记免疫试验 507

八、免疫荧光快速诊断 508

九、血清学实验 509

第十九章 水痘-带状疱疹病毒 510

一、概述 510

二、病毒的特性 510

三、病毒分离 511

四、病毒鉴定 512

五、显微镜检查 513

六、免疫荧光快速诊断 514

七、酶标记免疫试验 514

八、血清学实验 514

二、病毒的特性 516

一、概述 516

第二十章 巨细胞病毒 516

三、病毒分离 517

四、病毒鉴定 521

五、酶标记免疫试验 523

六、病毒的DNA测定 524

七、血清学实验 524

第二十一章 EB病毒 528

一、概述 528

二、病毒的特性 528

三、实验方法 528

(一) 病毒分离 528

(二) EBV感染引起的细胞转化 529

(三) EBV持续感染细胞株的建立 530

(四) EBV基因组在细胞内的存在形式 531

(五) EBV的定量法 532

(六) 免疫荧光试验 533

(七) 酶标记免疫试验 535

(八) 嗜异性凝集素试验 537

(九) 血清学实验 537

(十) EB病毒的致癌性 538

一、概述 540

二、病毒的特性 540

第二十二章 马立克病疱疹病毒 540

三、实验程序 541

四、病毒分离 541

五、病毒鉴定 542

六、酶标记免疫试验 542

七、血清学实验 544

细小病毒科 545

第二十三章 胃肠炎病毒 547

一、概述 547

二、病毒的特性 547

三、挪华克病毒实验指标 548

痘病毒科 549

第二十四章 天花病毒与痘苗病毒 553

一、概述 553

二、病毒的特性 554

三、实验程序 556

四、病毒分离 556

五、病毒鉴定 559

六、酶标记免疫试验 562

七、血清学实验 563

乳头多瘤空泡病毒科 564

二、病毒的特性 567

一、概述 567

第二十五章 多瘤病毒 567

三、细胞学 569

四、电镜观察 569

五、免疫电镜技术 570

六、免疫荧光试验 570

七、病毒分离 570

八、病毒鉴定 571

九、血清学实验 571

虹彩病毒科 572

三、病毒分离 573

二、病毒的特性 573

一、概述 573

第二十六章 非洲猪瘟病毒 573

四、病毒鉴定 575

五、血清学实验 575

小核糖核酸病毒科 577

第二十七章 脊髓灰质炎病毒 582

一、概述 582

二、病毒的特性 582

三、实验程序 586

四、病毒分离 587

五、病毒鉴定 589

六、免疫荧光快速诊断 598

七、酶标记免疫试验 599

八、血清学实验 600

第二十八章 柯赛基病毒 601

一、概述 601

二、病毒的特性 601

三、病毒分离 601

四、病毒鉴定 603

五、血清学实验 605

四、病毒鉴定 607

三、病毒分离 607

二、病毒的特性 607

一、概述 607

第二十九章 艾可病毒 607

五、酶标记免疫试验 609

六、血清学实验 609

第三十章 鼻病毒 610

一、概述 610

二、病毒的特性 610

三、病毒分离 610

四、病毒鉴定 615

(一) 中和试验 615

(二) 补体结合试验 616

(三) 生物学特性测定 617

五、酶标记免疫试验 619

第三十一章 肝炎病毒 620

第一节 甲型肝炎病毒 621

一、概述 621

二、病毒的特性 621

三、实验方法 621

(一) 甲型肝炎病毒测定 621

(二) 甲型肝炎抗原测定 624

1. 抗原提取法 624

2. 免疫粘连血凝试验 625

4. 酶标记免疫试验 626

3. 免疫电镜检测 626

第二节 乙型肝炎病毒 628

一、概述 628

二、病毒的特性 628

三、实验方法 632

(一) 乙型肝炎病毒核心颗粒与相关DNA聚合酶的测定 632

(二) 乙型肝炎抗原--抗体系统的测定 634

一、概述 648

二、病毒的特性 648

第三节 丙型肝炎病毒 648

三、实验方法 649

(一) 微量双相琼脂扩散(MO)法 649

(二) 固相放射免疫与免疫电镜观察 649

第三十二章 口蹄疫病毒 650

一、概述 650

二、病毒的特性 650

三、病毒分离 651

四、病毒鉴定 653

五、血清学实验 654

披膜病毒科 657

二、病毒的特性 664

第三十三章 流行性乙型脑炎病毒 664

一、概述 664

三、实验程序 666

四、病毒分离 666

五、病毒鉴定 668

六、免疫荧光快速诊断 669

七、酶标记免疫试验 670

八、血清学实验 671

三、病毒分离与鉴定 684

二、病毒的特性 684

一、概述 684

第三十四章 春夏型脑炎病毒 684

四、血清学实验 685

第三十五章 流行性出血热病毒 686

一、概述 686

二、病毒的特性 686

三、病毒分离与鉴定 688

四、血清学实验 690

第三十六章 登革热病毒 692

一、概述 692

二、病毒的特性 692

三、实验程序 693

四、病毒分离 694

五、病毒鉴定 697

六、免疫荧光试验 698

七、放射免疫测定 702

八、血清学实验 704

第三十七章 风疹病毒 706

一、概述 706

二、病毒的特性 707

三、实验程序 708

四、病毒分离 708

五、病毒鉴定 711

六、血清学实验 713

第三十八章 猪霍乱病毒 721

一、概述 721

二、病毒的特性 721

三、病毒分离 722

四、病毒鉴定 722

五、免疫荧光试验 723

六、酶标记免疫试验 724

七、直接蚀斑形成试验 725

八、血清学实验 728

本杨病毒科 729

第三十九章 本杨病毒 734

一、概述 734

二、病毒的特性 734

三、病毒分离 736

四、病毒鉴定 737

五、血清学实验 737

砂粒样病毒科 738

第四十章 砂粒样病毒 741

一、概述 741

二、病毒的特性 741

三、病毒分离 743

四、病毒鉴定 745

五、免疫荧光试验 746

六、酶标记免疫试验 747

七、血清学实验 747

正粘病毒科 749

第四十一章 流行性感冒病毒 751

一、概述 751

二、病毒的特性 751

三、流感病毒新的命名法 759

四、实验程序 761

五、病毒分离 761

六、病毒鉴定 765

七、免疫荧光快速诊断 766

八、酶标记免疫试验 767

九、血清学实验 769

(一) 血凝试验 769

(二) 血凝抑制试验 772

(三) 血凝抑制试验加敏法 774

(四) 微量血凝和血凝抑制试验 774

(五) 神经胺酸酶及其抑制试验 776

(六) 补体结合试验 780

(七) 单扩溶血试验 786

副粘病毒科 795

第四十二章 麻疹病毒 801

一、概述 801

二、病毒的特性 801

三、病毒分离 802

四、病毒鉴定 802

五、酶标记免疫试验 802

六、血清学实验 803

(一) 血凝抑制试验 803

(二) 微量血凝抑制试验 805

(三) 补体结合试验 812

四、病毒分离 813

三、实验程序 813

(一) 标本采取与处理 813

第四十三章 流行性腮腺炎病毒 813

一、概述 813

二、病毒的特性 813

(二) 组织培养分离法 814

(三) 鸡胚培养分离法 814

五、病毒鉴定 814

六、酶标记免疫试验 816

七、血清学实验 817

(二) 血凝抑制试验 818

(三) 单扩溶血试验 818

(一) 补体结合试验 818

第四十四章 副流感病毒 819

一、概述 819

二、病毒的特性 819

三、病毒分离 821

四、病毒鉴定 822

五、酶标记免疫试验 824

六、血清学实验 826

(一) 抗原制备 826

(四) 中和试验 828

(二) 血凝试验 828

(三) 血凝抑制试验 828

(五) 补体结合试验 829

第四十五章 呼吸道合胞病毒 830

一、概述 831

二、病毒的特性 831

三、实验程序 831

四、病毒分离 831

五、病毒鉴定 833

六、血清学实验 833

二、病毒的致病力和病毒株分类 835

一、概述 835

第四十六章 新城疫病毒 835

三、病毒的生物学特性 836

四、病毒分离与鉴定 838

五、血清学实验 839

日冕形病毒科 842

第四十七章 日冕形病毒 845

一、概述 845

二、日冕形病毒的特性 845

三、引起人类呼吸道感染的病毒类型 848

四、实验程序 850

五、病毒分离 851

六、呼吸道感染病毒的鉴定 855

七、血清学实验 855

呼肠孤病毒科 858

第四十八章 呼肠孤病毒 862

一、概述 862

二、病毒的特性 862

三、病毒分离 862

四、病毒鉴定 866

五、血清学实验 868

一、概述 869

第四十九章 轮状病毒 869

二、病毒的特性 870

三、病毒分离 871

四、电镜和免疫电镜观察 872

五、免疫荧光试验 872

六、酶标记免疫试验 873

七、血清学实验 873

弹状病毒科 876

第五十章 水泡性口膜炎病毒 878

一、概述 878

二、病毒的特性 878

三、病毒分离与鉴定 879

四、血清学实验 880

第五十一章 狂犬病毒 881

一、概述 881

二、病毒的特性 881

三、实验程序 882

四、病毒分离 883

五、病毒鉴定 885

六、免疫荧光快速诊断 885

七、酶标记免疫试验 886

(二) 补体结合试验 887

(三) 微量血凝抑制试验 887

(一) 中和试验 887

八、血清学实验 887

逆转录病毒科 888

第五十二章 肿瘤病毒 890

一、概述 890

二、肿瘤病毒亚科的类型和特性 890

(一) 病毒类型 892

(二) 肿瘤病毒的特性 892

三、人肿瘤病毒病因与研究方案 895

(一) 研究人肿瘤病毒的方案 896

(二) 几类可疑的人肿瘤病毒 898

(一) 流行病学 904

四、研究人肿瘤病毒的有关技术 904

(二) 电镜检查 905

(三) 细胞培养 905

(四) 免疫学方法 906

(五) 生物化学与分子生物学 907

(六) 病毒的诱导或活化 907

(七) 病毒鉴定 907

(八) 病毒的致癌性 907

(九) 疫苗预防 908

三、实验程序 909

四、病毒分离 909

第五十三章 马传染性贫血病毒 909

二、病毒的特性 909

一、概述 909

五、病毒鉴定 910

六、血清学实验 910

附录 915

一、人、畜的主要病毒科索引 915

二、脊椎动物病毒培养细胞一览表 926

后记 935